Narodil se v Přerově 20. února 1523 v přední měšťanské rodině. Základní vzdělání získal na školách Jednoty bratrské v Přerově a Prostějově a Jednotou byl také poslán na vyšší studia do Goldbergu ve Slezsku a do Wittenbergu, kde se seznámil s Martinem Lutherem a humanistickými spisy jeho blízkého spolupracovníka a přítele Filipa Melanchthona. Po návratu pokračoval ve svém vzdělávání v Přerově a posléze v Mladé Boleslavi. Krátce studoval na univerzitách v Královci a Basileji. Všechny tyto vlivy pomáhaly utvářet jeho humanistickou osobnost i pracovní styl, osvojil si humanistické metody (hledání pravdy, návrat k pramenům, systematické utřídění látky, jasný a srozumitelný výklad) a využíval je v širokých oblastech svých zájmů - v historii, jazykovědě, hudbě, překladatelské a jiné literární činnosti.

V roce 1533 se stal knězem a roku 1557 biskupem. Byl také písařem, archivářem a histogramem Jednoty bratrské. Jednotu bránil historickými spisy (O původu Jednoty a řádu v ní) i nábožensko-morálními traktáty (Spis o zraku, Sepsání o rozdíle Jednoty bratrské od luteránské). Záležitostmi Jednoty se zaobíral i v drobnějších pracích mravokárných (Anvolimator) a pedagogických (Vitia concionatorum, Naučení mládencům).

Širší ohlas měla Filipika proti misomusům, v níž se postavil na obranu vyššího vzdělání kazatelů Jednoty bratrské. Vedle Šamotulského a Ivančického kancionálu (sborník náboženských písní), sepsal i hudebně teoretický spis v českém jazyce Musica. Gramatika česká je pak věnována naléhavým otázkám školské a kazatelské praxe a bere přitom v úvahu nejen další slovanské jazyky, ale i domácí nářečí a určuje jazykovou správnost. Blahoslav je také autorem prvního českého Slabikáře. Nejvýznamnějším počinem je ale jeho stylisticky vybroušený překlad "Nového zákona". Překlad se stal podnětem a vzorem překladatelům ostatních knih Písma a byl vložen jako šestý díl do Kralické bible.

Jan Blahoslav zemřel 24. listopadu 1571 na vizitační cestě v Moravském Krumlově.